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基因修饰小鼠|聊聊显微操作技术

2021-12-21 文章来源: 浏览量: 分享到:

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显微操作技术,是指在光学显微镜或解剖镜下,进行手术、解剖和注射等试验操作的技术。在模式动物和辅助生殖领域,常用的显微操作技术,包括:原核注射、胞质注射、8-cell注射、囊胚注射、四倍体胚胎注射、2-cell注射和胞质内单精注射(ICSI)等。这些技术的特点,是通过研究配子(精子、卵子和受精卵)、辅助细胞(卵巢或者睾丸支持细胞)和干细胞(多能性或全能性干细胞)等,在细胞或者亚细胞水平,阐明受精和胚胎发育的机制,提供更优的体外培养条件,或者更科学无害的产前诊断方案。


这些技术可以简单的归为三类:

(1)胚胎或配子移植或操作,如胚胎移植,体外受精(IVF),或者将DNA、RNA、蛋白、病毒、染料或其他体育材料的原核或者胞质注射等;

(2)亚细胞水平的移植,如细胞核移植,线粒体移植等;

3)多能性细胞分化,转分化或者重组胚胎,如ES细胞诱导分化成胚胎等。


这些技术中多数已经商业化普及(如下表)。

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原核注射技术


原核显微注射技术将目的样品注入小鼠或大鼠的受精卵原核中,选择易于注射的原核,雌原核和雄原核均可,注射完毕后,将受精卵移植入假孕母鼠输卵管内,待仔鼠出生后,用PCR方法筛选整合外源基因的阳性仔鼠。完成该技术一般步骤,包括:

1)卵细胞固定针和原核注射针的制作;

(2)操作盘的制作;

(3)在原核注射针中,用微量加样枪加入样品;

(4)调整好显微镜、操作臂和微量样品连续注射仪(如Fomtojet),将固定针和注射针固定在操作臂上,在操作盘中将针尖碰断成小于1μm的斜口,长按Clean键,排出针中可能存在的气泡;

(5)原核期胚胎放到操作盘中,开始原核注射,若针断口合适,1~2秒钟即可以看到原核膨胀,1个小时可以注射约100枚原核期胚胎。转基因的阳性率平均在3%左右,具体项目的成功率高低,与注射片段的大小紧密相关。

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胞质注射技术


胞质注射技术,是在Crispr技术出现后兴起的注射技术,因为基因敲除(KO)的效率高,是制作基因敲除动物的首选。胞质注射技术,与原核注射基本类似,只是胞质可以容纳更大的体积,但看不到细胞的膨胀。一般原核注射,细胞核膨胀的体积在1~2pL,胞质中可以容纳10~1000倍的量。因而,除了用原核注射针注射,也可以选用Pizeo辅助的单精子注射针(ICSI)注射。胞质注射时,一定要确认注射针扎透了卵胞质膜,若没有穿过质膜,注射的液体会在质膜与针尖之间形成一个小液滴;遇到这种情况,需要重新注射。对于有DNA模板同源重组的基因敲入(KI)项目,也可以采用原核和胞质同时注射的方法。对于2-cell期的胚胎,也可以采用胞质或原核与胞质同时注射的方法。


囊胚注射、四倍体胚胎、8-cel注射技术


囊胚注射技术,是指将多能性的ES细胞,注射到处于扩张囊胚时期的囊胚腔中,移植到代孕小鼠输卵管,或者子宫中获得嵌合鼠的技术。若嵌合鼠可以种系传递,则可以将基因打靶修饰过的ES细胞,转变成活的基因编辑小鼠用于实验研究。该技术适宜于基因编辑效率低的基因修饰项目,在ES细胞水平筛选阳性克隆后(一个10cm 培养皿有1000万个细胞,通过抗性基因筛选富集阳性ES克隆,比同等数量的大小鼠胚胎的成本低多个数量级),再制作嵌合体大小鼠。


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因为嵌合体存在不种系传递的风险,体育学家研发了2条制造ES小鼠的新途径:

(1)四倍体胚胎注射,在小鼠胚胎2-cell阶段,通过电熔合仪,将胚胎融合成1-cell,因融合后胚胎细胞中含有两套染色体,这个胚胎称为四倍体胚胎,发育到囊胚阶段后,可以进行ES细胞的囊胚注射。因为多倍体不能发育成胎儿本身,只有一部分参与胎盘的行程,有利于着床,因而获得的嵌合鼠均来源于ES细胞本身,称为ES小鼠。尽管该技术一步可以获得ES小鼠,但成功率低,特别是ES小鼠的异常率比较高(如大胎儿综合征、幼崽死亡率高等),且对背景依赖大,一般ES细胞的品系背景背景为F1代(如B6D2F1),嵌合用囊胚的背景为F2代(B6D2F1*B6D2F1);

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(2)8-cell胚胎注射,将ES细胞注射到8-cell阶段胚胎的透明带下,然后将嵌合胚胎移植到代孕受体的输卵管中,该方法获得嵌合鼠的嵌合比例高,其中部分仔鼠嵌合率高于90%,即一步可以获得ES小鼠。囊胚注射和8-cell注射,均可以用斜口吊尖针或者激光破膜仪(xyclone)辅助的平口针制作。影响嵌合效率的一个关键因素,是ES细胞的质量,近年有文献研究表明,在8-cell阶段的胚胎,注射1个ES细胞即可获得种系传递的ES小鼠。因而,要尽量选择已经证明具有高效嵌合和种系传递能力的细胞系。


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《小鼠胚胎操作指南》(Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory Manual)是小鼠实验的圣经,若专业从事显微注射工作,建议多读几遍,会对精通该技术起到事半功倍的效果。这里简介一下要点:

(1)超排,不同品系大小鼠的超排方案存在差异,一般小鼠激素是5IU;大鼠是30IU。时间根据当地的特点、季节等因素微调,小鼠P13:00~14:00;H11:00~12:00(间隔46~47h);大鼠P11:00~13:00;H11:00~14:00(间隔48~49h)。

(2)公鼠每周使用1~2次;要记录挑选好的公鼠,淘汰不好用的公鼠。代孕雌鼠一旦不发情、过胖或消瘦,立即淘汰。要区别真正的栓plug与milk的区别,只选择硬的明显凝固的plug的代孕鼠。输卵管移植时,选择膨大部明显的进行移植。

(3)质粒DNA,BAC和RNA等,使用的浓度与片段大小相关,按照文献建议的要求进行;也可以在注射时,设立不同的浓度梯度。遇到太黏堵针,常用的处理方法有三种:离心(大片段BAC 3000转离心后4℃保存;小片段2万转离心后4℃保存);过滤;重新准备。


辅助生殖技术是确保模型小鼠满足CRO、科研和生产需要的基本技术,可以解决小鼠准备和扩繁过程中遇到的各种问题。辅助生殖技术在大小鼠模型领域的应用主要包括:快速扩繁、胚胎移植、胚胎净化、精子冷冻等。天博可以提供原核注射,囊胚注射,输卵管移植,子宫移植和其他各种显微手术。


对于显微注射服务,可以按照客户要求,进行不同品系、不同阶段和不同剂量(或数量)的注射,也可以进行特定细胞,病毒,染料或其他体育材料的注射服务。同时,也可以开展各种显微手术和解剖服务


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